Dados do Resumo

Título

RNAseq-alvo para auxiliar a reclassificação de variantes de significado clínico incerto preditas de impactar o splice em genes de predisposição hereditária ao câncer

Introdução

Variantes de significado clínico desconhecido (VUS) ainda representam uma parcela significativa das variantes identificadas em testes genéticos para investigação de síndromes de predisposição ao câncer. Dentre todas as VUS identificadas em sequenciamento de NGS, as VUS de splice são as mais encontradas após as VUS missenses.

Objetivo

Os objetivos do estudo são: estabelecer um conjunto de ferramentas genômicas e computacionais que permitam a reclassificação de VUS codificantes ou não codificantes com possível efeito em splice (spliceogênicas); validar um painel de captura de RNA de 27 genes de predisposição ao câncer.

Métodos

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo CEP sob o nº 3051/21. Arquivos VCFs de testes genéticos de DNA realizados previamente no Laboratório de Diagnóstico Genômico e em projetos de pesquisa do A.C Camargo que avaliaram de 26 a 126 genes de predisposição hereditária ao câncer foram reavaliados utilizando o software Varseq. Variantes raras exônicas (sinônimas, missenses) e não codificantes (intrônicas até 20 pb do limite do éxon e nas regiões 5’ e 3’ UTR) foram filtradas e avaliadas por ferramentas de predição de splice (MaxEntScan, dbscSNV e SpliceAI) e de impacto na 5’ UTR (UTRannotator). O sequenciamento alvo de RNA (RNAcap) está sendo realizado em pacientes com variantes previstas de alterar splicing, utilizando RNA de leucócitos ou tecido normal. Os padrões de splicing estão sendo analisados pelos softwares rMATS e LeafCutter.

Resultados

Realizamos a revisão e avaliação in silico dos VCFs de 2.084 pacientes, correspondendo a 4.726 variantes únicas. Destas, 149 variantes únicas são previstas de afetar splice em pelo menos um preditor e 32 de impactar a função da região 5’UTR. Para a validação do painel RNAcap de 27 genes, 40 pacientes foram identificados com 29 variantes P/PP spliceogênicas únicas, e 51 pacientes com 33 VUS únicas. Foi realizado o sequenciamento de RNAcap em 52 pacientes (16 com variantes P/PP, 17 com VUS e 19 controles). Obteu-se um enriquecimento médio de 33% para as regiões alvo, e a média de cobertura por base >50X foi de 96,3%. A ferramenta rMATS identificou mais eventos de splice aberrantes em comparação com LeafCutterMD tanto em pacientes com variantes P/PP (8 vs. 5), quanto os de VUS (3 vs. 0), ambas concordaram em apenas 3 variantes P/PP. A maior parte das VUS avaliadas até o momento não apresentaram defeitos significativos em splice e estão propensas a serem reclassificadas para B/PB.

Conclusões

Estabelecemos critérios e um pipeline automatizado para a seleção de variantes raras codificantes e não codificantes previstas de alterar splice e padronização para análise de splicing diferencial. RT-PCR seguido de sequenciamento está sendo realizado em todas as VUS para validar seu efeito ou não em splice. Adicionaremos a ferramenta Fraser para análise de splicing diferencial. Esperamos que os dados obtidos auxiliem na reclassificação de parte das variantes avaliadas.

Financiador do resumo

FAPESP e CAPES

Palavras Chave

RNA-seq alvo; Splicing; Câncer hereditário