Dados do Trabalho

Título

Geração de um modelo celular nocaute para a proteína BRCA1 em células tumorais de linhagem de câncer de ovário

Introdução

A técnica de edição genética CRISPR-Cas9 permite a precisa modificação de genes, incluindo a inativação direcionada de um gene específico, conhecida como nocaute genético. Utilizando um RNA guia (sgRNA) complementar ao gene alvo, a enzima Cas9 introduz quebras no DNA, levando à sua desativação. Esta abordagem foi empregada no nocaute do gene BRCA1, notório por sua importância em reparo de DNA e prevenção de câncer. A utilização do CRISPR permite um maior conhecimento sobre a função do gene e suas conexões com doenças genéticas e câncer.

Objetivo

O objetivo do projeto é realizar a geração de um modelo celular nocaute para a proteína de interesse BRCA1 para que deste modo pudéssemos realizar ensaios funcionais capazes de responder se alterações nessa proteína poderia aumentar ou diminuir a agressividade de células tumorais de câncer de ovário.

Métodos

A inibição do gene BRCA1 foi realizada através da metodologia CRISPR-Cas9, que emprega a enzima Cas9 guiada por sgRNAs até a região de interesse no genoma. A Cas9 provoca quebras na dupla hélice do DNA no local alvo. Após a clivagem, as vias de reparo celular entram em ação para restaurar a região danificada. O reparo por junção de pontas não homólogas, sem uma fita molde, pode gerar mutações chamadas indels. Essas mutações, ocorrendo em éxons codificadores, podem causar mudanças de fase de leitura e códons de parada, levando a nocautes. Um plasmídeo contendo Cas9, genes de resistência e sgRNAs foi usado para direcionar a Cas9 ao sítio de interesse no genoma celular. O objetivo era criar células nocauteadas pelo sistema CRISPR-Cas9, com sgRNAs focados nos primeiros éxons do gene BRCA1 para evitar variantes de splicing e impedir proteínas truncadas com atividade residual. Neste estudo, a versão CRISPR-Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes foi utilizada, requerendo uma sequência PAM (motivo de reconhecimento) imediatamente após o local alvo.

Resultados

Inicialmente foram feitas as sgRNA por meio de uma plataforma online, na qual a sequência de nucleotídeos do DNA na área alvo do genoma a ser editada foi inserida como entrada. Essa ferramenta gerou uma lista de possíveis guias de RNA com índices de especificidade que refletem os efeitos off-target da guia no genoma humano. Após a criação das guias, procedeu-se à desfosforilação destas e à fosforilação do plasmídeo, a fim de facilitar a subsequente inserção das guias no plasmídeo de interesse, por meio da clivagem com a enzima BbsI. Com a ligação das guias no plasmídeo, o produto foi transformado nas bactérias da linhagem E. coli DH5α. As colônias bacterianas resultantes foram coletadas, e o DNA foi extraído e submetido a testes de clivagem com BbsI, bem como o sequenciamento de nova geração de amplicons para validação.

Conclusões

A criação e seleção das sgRNA permitiu identificar sequências específicas de primers. A clivagem precisa usando a enzima BbsI foi confirmada em gel de agarose. A transformação eficaz, não clivagem e sequenciamento reforçaram a confiabilidade. Estes resultados enfatizam a solidez da estratégia de criação de um plasmídeo contendo o gene BRCA1 nocauteado. Os próximos passos incluem a transfeção do plasmídeo em células de câncer de ovário, seguida de seleção com antibiótico o qual o plasmídeo fornece resistência e posterior inserção de mutações para testes funcionais.

Palavras-chave

CRISPR-Cas9, Gene BRCA1, Nocaute genético

Financiador do resumo

CAPES

Área

Estudo Clínico - Tumores Ginecológicos