Dados do Trabalho

Name: Next Frontiers to Cure Cancer
Start: 2023-09-15
End: 2023-09-16
Location: Expo Center Norte (Pavilhão Amarelo)

Título

Análise funcional de expressão de MUTYH em contextos monoalélicos e bialélicos e sua implicação em risco de desenvolvimento de câncer gástrico

Introdução

MUTYH é uma glicosilase responsável no mecanismo de reparo de excisão de bases da lesão 8-oxoG, que causa a transversão GC:TA, após eventos replicativos do DNA. Tumores de pacientes portadores de variantes patogênicas (VP) bialélicas apresentam uma assinatura mutacional associada à lesão 8-oxoG que está ausente em tumores de portadores de VP monolélicas. Os mecanismos envolvidos na tumorigenese dessas duas condições e na geração dessa assinatura mutacional não são totalmente conhecidos.

Objetivo

Desenvolver ensaios funcionais nas linhagens de células tumorais gástrica selvagem e nocalteadas para o gene MUTYH na condição mono e bialélica, através da técnica de CRISPR/Cas9, para auxiliar na compreensão dos mecanismos associados ao desenvolvimento e da assinatura mutacional por 8-oxoG

Métodos

A linhagem celular derivada de adenocarcinoma gástrico AGS nocauteada para o gene MUTYH e a linhagem selvagem estão sendo utilizadas para os seguintes experimentos: reseleção dos clones desenvolvidos para a confirmação da edição gênica para o gene MUTYH – os clones foram reselecionados com 0,5 g/mL de puromicina, o DNA extraído com o kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit, o qual foi submetido a PCR para obtenção dos amplicons referentes ao exon 2 do gene MUTYH e, posteriomente, o sequenciamento; ensaio de viabilidade celular (MTT) – avaliação e comparação da viabilidade celular após o tratamento com concentrações crescentes de cisplatina (entre 2 e 50 uM) por 24 h; imunofluorescência para análise da lesão 8-oxoG – as células foram incubadas com o oxidante KBrO3 a 20 mM por 30 minutos, a fim de induzir o dano no DNA 8-oxoG, e através da marcação com o anticorpo anti-8-oxoG, mitotracker e DAPI, avaliar e comparar a presença ou ausência da lesão na mitocôndria ou núcleo das células.

Resultados

VPG bialélica em MUTYH estão associadas a MAP (polipose associada a MUTYH) que é uma síndrome autossômica recessiva que aumenta significativamente o risco do portador de desenvolver câncer colorretal com polipose e VPG monoalélica em MUTYH parece aumentar o risco do portador de desenvolver tumor gástrico. Assim para investigar essas duas condições alélicas, foram desenvolvidas, através da técnica CRISPR/Cas9, construções com guias direcionadas para o éxon 2 do gene, para estabelecer um modelo em células de câncer gástrico para o estudo da deficiência de MUTYH nas condições mono e bialélica. O sequenciamento do DNA dos clones editados validou a eficiência das construções. Desse modo, descrevemos um importante modelo para o entendimento das funções biológicas de MUTYH, que contribuirá para desvendar os mecanismos biológicos envolvidos na formação de tumores em diferentes tecidos. O ensaio de imunofluorescência está em fase de padronização, assim como o ensaio de viabilidade celular.

Conclusões

Os ensaios funcionais na linhagem de células tumorais gástrica selvagem e noucateada para o gene MUTYH estão sendo gerados para avaliar a existência de assinatura mutacional característica associada a mutações mono ou bialélicas em MUTYH. Esse estudo contribuirá com a compreensão dos mecanismos envolvidos na tumorigenese desses dois tipos de tumores e do processo mutacional pela avaliação da assinatura de 8-oxoG.